Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных – филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»
СОЗДАНИЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СЛИТОГО БЕЛКА (КОМПЛЕКСА Г-КСФ И ЛАКТОФЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА) С ЛИЗИРУЕМОЙ СВЯЗЬЮ
- Номер: 4
- Год: 2015
- Страницы: 5-17
Журнал: Проблемы биологии продуктивных животных
Аннотация:
При получении трансгенных животных, продуцирующих с молоком биологически активные вещества человека фармакологического назначения может происходить нарушение тканеспецифической экспрессии трансгена и попадание этих высокоактивных веществ в кровь плодов, что может приводить к их гибели или к возникновению заболеваний у родившихся животных. Целью исследований было создание конструкции, экспрессирующей гранулоцит-колониестимулирующего фактора человека (hGCSF) в молочной железе млекопитающих в неактивной форме. Была создана конструкция, в которой структурный ген hGCSF слит с геном лактоферрина человека hLF. Для создания новой рекомбинантной плазмиды, содержащей hGCSF, слитый с hLF, были сконструированы праймеры к гену hGCSF, содержащие уникальный сайт рестрикции для Bsu36I и нуклеотидную последовательность, обеспечивающую синтез аминокислотной последовательности, специфически гидролизуемой бактериальной протеазой (в прямом праймере). Из ранее полученной плазмиды pβLgGСSFcmvEGFP был амплифицирован фрагмент ДНК, содержащий ген hGCSF, который был проклонирован в промежуточный вектор pTZ57R/T. Из трансформированных клеток E. coli TG1 были выделены и наработаны клоны, содержащие pTZ57R/GСSF. Из pTZ57R/GСSF с помощью рестриктазы Bsu36I (Eco81I) выделили ген hGCSF с фрагментом, обеспечивающим формирование аминокислотной последовательности для бактериальной IgA-протеазы. Плазмиду pαs1Lf обработали рестриктазой Bsu36I (Eco81I) и дефосфорилировали щелочной фосфатазой. Фрагмент GCSF/Bsu36I лигировали с подготовленной плазмидой pαs1Lf/Bsu36I/AlPh, после чего провели трансформирование клеток E.coli TG1. Выросшие на селективной среде клоны были проверены методом ПЦР-анализа на наличие генов hGCSF и hLF. Выбранный клон был дополнительно подвергнут рестриктному анализу. Плазмида pαs1Lf/GCSF предназначается для получения трансгенных животных, продуцирующих в молоко регуляторные белки человека в неактивном состоянии, которые могут быть выделены в активной форме после обработки слитого белка бактериальной протеазой.
Литература:
1. Езерский В.А., Иванова Л.Б., Шевченко В.Г. Получение плазмиды, содержащей структурный ген лактоферрина человека под контролем регуляторных элементов гена αs1-казеина быка // Научные труды ВНИИФБиП. − 2004. – T. 43. − С. 52-67.
2. Езерский В.А., Иванова Л.Б., Шевченко В.Г. Создание генно-инженерной конструкции, содержащей структурный ген GCSF человека под контролем регуляторных элементов гена b-лактоглобулина крупного рогатого скота // Проблемы биологии продуктивных животных. − 2007. − № 1. − С. 123-131.
3. Езерский В.А., Колоскова Е., Трубицина Т.П., Шевченко В.Г., Рябых В.П. Тест-система для определения лактоферрина человека в молоке кроликов с интегрированной в геном конструкцией αs1-Cn-hLf // Проблемы биологии продуктивных животных. − 2012. −№ 4. − С. 108-115.
4. Максименко О.Г., Дейкин А.В., Ходарович Ю.М., Георгиев П.Г. Использование трансгенных животных в биотехнологии: перспективы и проблемы // Acta naturae. − 2013. − Т. 5. − № 1.− С. 33-47.
5. Прокофьев М.И., Городецкий С.И., Косоруков В.С., Мезина М.Н., Юткин Е.В., Елагин В.В., Пинюгина М.Н.. Получение человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора с молоком трансгенных животных // Российский биотерапевтический журнал. − 2002. − Т. 3. − № 1. − С. 49-55.
6. Прокофьев М.И., Городецкий С.И., Мезина М.Н., Юткин Е.В., Косоруков В.С., Букреев Ю.М., Антипова Т.А., Пинюгина М.Н., Карелина Т.К., Звездин А.В., Краевой С.А. Создание трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор // Сельскохозяйственная биология. − 2003. − № 6. − С. 49-54.
7. Тевкин С.И., Трубицина Т.П., Езерский В.А., Рябых В.П. Развитие in vitro и интеграция трансгена в геном предимплантационных эмбрионов кролика после микроинъекции различных генно-инженерных конструкций // Проблемы биологии продуктивных животных. − 2010. − № 3.− С. 86-95.
8. Тевкин С.И, Трубицина Т.П., Шишиморова М.С., Езерский В.А., Рябых В.П.. Частота интеграции трансгена и жизнеспособность кроличьих зигот, микроинъецированных разными генно-инженерными конструкциями // Технологии живых систем. − 2010. − № 7. − С. 42-49.
9. Baldassarre H., Deslauriers J., Neveu N., Bordignon V. Detection of endoplasmic reticulum stress markers and production enhancement treatments in transgenic goats expressing recombinant human butyrylcholinesterase // Transgenic Res. − 2011. − Vol. 20. − No. 6. − P. 1265-72.
10. Bosze Z., Hiripi L., Carnwath J.W., Niemann H. The transgenic rabbit as model for human diseases and as a source of biologically active recombinant proteins // Transgenic Research. − 2003. − Vol. 12. − P. 541–553.
11. Castro F.O., Toledo J.R., Sánchez O., Rodríguez L. All roads lead to milk: Transgenic and non-transgenic approaches for expression of recombinant proteins in the mammary gland // Acta Scientiae Veterinariae. − 2010. − Vol. 38. − Suppl 2. − P. 615-626.
12. Ebert R.M., Selgrath J.P., DiTullio P., Denman J., Smith T.E., Vitale J.A., Gordon K. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression //Bio/Technology. − 1991. − Vol. 9. − P. 835-842.
13. Gordon K.E., Lee J.A.,Vitale A.E., Smith H., Hennighausen L. Production of human Tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk // Bio/Technolology. − 1987. − Vol. 5. − P. 1183-1189.
14. Houdebine L.M. The production of pharmaceutical proteins from the milk of transgenic animals // Reprod. Nutr. Develop. − 1995. − Vol. 35. − P. 609-617.
15. Houdebine L.M. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals // Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. − 2009. − Vol. 32. − P. 107-121.
16. Kim M.O., Kim S.H., Shin M.J., Lee D.B., Kim T.W., Kim K.S., Ha J.H., Lee S., Park Y.B., Kim S.J., Ryoo Z.Y. Human erythropoietin induces lung failure and erythrocytosis in transgenic mice // Mol Cells. − 2007. − Vol. 23. − No. 1. − P. 17-22.
17. Korhonen V.P, Tolvanen M., Hyttinen J.M., Uusi-Oukari M., Sinervirta R., Alhonen L., Jauhiainen M., Jänne O.A., Jänne J. Expression of bovine beta-lactoglobulin/human erythropoietin fusion protein in the milk of transgenic mice and rabbits // Eur. J. Biochem. − 1997. − Vol. 245. − No. 2. − P. 482-489.
18. Lee S.H., de Boer H.A. Production of biomedical protein in the milk of transgenic dairy cows: state of the art // J. Controlled Release. − 1994. − Vol. 29. − P. 213-218.
19. Maga E.A., Murray J.D. Mammary gland expression of transgenes and the potential for altering the properties of milk // Biotechnology. − 1995. − Vol. 13. − P. 1452-1457.
20. Moura R.R., Melo L.M., and Freitas V.J.F. Production of recombinant proteins in milk of transgenic and non-transgenic goats // Braz. Arch. Biol. Technol. − 2011. − Vol. 54. − No. 5. − P. 927-938.
21. Niemann H., Kues W.A. Transgenic livestock: premises and promises // Anim. Reprod. Sci. − 2000. − Vol. 66. − P. 277-293.
22. Pohlner J., Halter R., Beyreuther K., Meyer T.F. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease // Nature. − 1987. − Vol. 325. − No. 6103. − P. 458-62.
23. Pohlner J., Klauser T., Kuttler E., Halter R. Sequence-specific cleavage of protein fusions using a recombinant Neisseria type 2 IgA protease // Biotechnology (N.Y).–1992. − Vol. 10. − No. 7. − P. 799-804.
24. Pohlner J., Krämer J., Meyer T.F. A plasmid system for high-level expression and in vitro processing of recombinant proteins // Gene. − 1993. − Vol. 130. − No. 1. − P. 121-126.
25. Pompejus M., Friedrich K., Teufel M., Fritz H.J. High-yield production of bacteriorhodopsin via expression of a synthetic gene in Escherichia coli // Eur. J. Biochem. − 1993. − Vol. 211. − No. 1-2. − P. 27-35.
26. Semenza G.L., Traystman M.D., Gearhart J.D., Antonarakis S.E. Polycythemia in transgenic mice expressing the human erythropoietin gene // Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). − 1989. − Vol. 86. − No. 7. − P. 2301-2305.
27. Simons J.P.,Wilmut I. Clark A.J., Archibald A.L., Bishop J.O. Gene transfer into sheep // Bio/Technology. − 1988. − Vol. 6. − P. 179-186.
28. Soler E., Thepot D., Rival-Gervier S., Jolivet G., Houdebine L.-M. Preparation of recombinant proteins in milk to improve human and animal health // Reprod. Nutr. Dev. − 2006. − Vol. 46. − P. 579-588.
29. Wall R.J., Pursel V.G., Shamay A., Hennighausen. High-level synthesis of a heterologus milk protein in the mammary glands of transgenic swine // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. − 1991. − Vol. 88. − P. 1696 -1704.
30. Wood S.G., Burton J. Synthetic Peptide Substrates for the Immunoglobulin Al Protease from Neisseria gonorrhoeae (Type 2) // Infection and immunity. − 1991. − Vol. 59. − No. 5. − P. 1818-1822.
31. Zabetian M., Tahmoorespur M., Hosseini Kh. The application of transgenic rabbits in agriculture and biomedicin // Journal of Animal and Veterinary Advances. − 2011. − Vol. 10. − No. 6. − P. 780-790.