Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных – филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»
Бета-лактоглобулин – основной белок молочной сыворотки почти у всех млекопитающих, кроме грызунов и приматов. Регуляторные районы гена бета-лактоглобулина (BLG) овец, коз и крупного рогатого скота применяют в составе генетических конструкций. Цель данной работы – создание плазмиды, содержащей 5’- и 3’- плечи гомологии к гену бета-лактоглобулина крупного
рогатого скота. Фрагмент, содержащий ген биологически активного белка, может быть встроен в полученную плазмиду по сайту для рестриктазы EagI на стыке плечей гомологии. Полученная ДНКматрица предназначена для сайт-специфичной интеграции гомологичной рекомбинацией в ген бета-лактоглобулина крупного рогатого скота при использовании CRISPR/Сas9 технологии. Для подбора сайтов внесения двухцепочечных разрезов был определен полиморфный вариант гена BLG быка, сперму которого предполагается использовать для оплодотворения яйцеклеток коровы в условиях in vitro. Была разработана стратегия внесения двухцепочечных
разрезов в ген BLG и получены четыре плазмиды pX330, кодирующие эндонуклеазу Cas9 и направляющие РНК, специфичные к последовательностям гена BLG. Плазмида pBLGcmvEGFP,
содержащая ген зеленого флуоресцентного белка под цитомегаловирусным промотором, предназначена для сайт-специфичной интеграции гомологичной рекомбинацией в ген беталактоглобулина для оценки эффективности сайт-специфической работы компонентов системы CRISPR/Сas9 в условиях in vitro.
1. Ларкина Т.А., Крутикова А.А., Козикова Л.В. Редактирование генома сельскохозяйственных животных
с помощью технологии CRISPR/Cas9 // Молочнохозяйственный вестник. – 2018. – № 3. – С. 24-35.
2. Езерский В.А., Шевченко В.Г. Создание генно-инженерной конструкции, содержащей структурный ген
лактоферрина человека под контролем регуляторных элементов гена β-лактоглобулина крупного
рогатого скота и репортерный ген GFP // Проблемы биологии продуктивных животных. – 2008. – № 2. –
С. 3-12.
3. Гладырь Е.А. ДНК-диагностика вариантов генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у крупного
рогатого скота: автореф. дисc… к.б.н., Подольск-Дубровицы, ВИЖ, 2001. – 20 c.
4. Колоскова Е.M., Езерский В.А. Особенности выделения и очистки плазмидной ДНК из трансформированных штаммов E.coli DH5α и E.coli TG1 // Проблемы биологии продуктивных животных. – 2019.
– № 4. – С. 105-112.
5. Мензоров А.Г., Лукьянчикова В.А., Кораблев А.Н., Серова И.А., Фишман В.С. Практическое
руководство по редактированию геномов системой CRISPR/Cas9 // Вавиловский журнал генетики и
селекции. – 2016. – Т. 20. – № 6. – С.930-944. DOI 10.18699/VJ16.214
6. Трубицина Т.П., Рябых В.П., Колоскова Е.М., Езерский В.А., Максименко С.В. Использование гена β-
лактоглобулина при получении рекомбинантных белков - от старых технологий трансгенеза к новым
методам редактирования генома (обзор) // Проблемы биологии продуктивных животных. – 2018. – № 3.
– С. 15-34.
7. Шепелев М.В., Калиниченко С.В., Дейкин А.В., Коробко И.В. Получение рекомбинантных белков из
молока трансгенных животных: современное состояние и перспективы // ACTA NATURAE. – 2018. – Т.
10. – № 3. – С. 42-50.
8. Bishop T.F. and Van Eenennaam A.L. Genome editing approaches to augment livestock breeding programs // J.
Exp. Biol. – 2020. – Vol. 223. - jeb207159. DOI:10.1242/jeb.207159
9. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang
F. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems // Science. – 2013. – Vol. 339. – No. 819. DOI:
10.1126/science.1231143.
10. Cui C., Song Y., Liu J., Ge H., Li Q., Huang H., Hu L., Zhu H., Jin Y., Zhang Y. Gene targeting by TALENinduced homologous recombination in goats directs production of β-lactoglobulin-free, high-human lactoferrin
milk // Sci. Rep. – 2015. – Vol. 5. – P.10482. DOI:10.1038/srep10482
11. Kato M., Yamanouchi K., Ikawa M., Okabe M. Efficient selection of transgenic mouse embryos using EGFP as
a marker gene // Mol. Reprod. Dev. – 1999. – Vol. 54. – P. 43-48.
12. Luo Y.,. Wang Y., Liu J., Cui C., Wu Y., Lan H., Chen Q., Liu X., Quan F., Guo Z., Zhang Y. Generation of
TALE nickase-mediated gene-targeted cows expressing human serum albumin in mammary glands // Sci. Rep.
– 2016. – Vol. 6. – P. 20657. DOI: 10.1038/srep20657.
13. Medrano J.F., Aguilar-Cordova Е. Polymerase chain reaction amplification of bovine β-lactoglobulin genomic
sequences and identification of genetic variants by RFLP analysis // Anim. Biotechnol. – 1990. – Vol. 1. – P. 73-
74. DOI:10.1080/10495399009525730.
14. Menchaca A., Dos Santos-Neto P.C., Mulet A.P., Crispo M. CRISPR in livestock: From editing to printing //
Theriogenology. – 2020. – Vol. 150. – P. 247-254. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2020.01.063.
15. Song S., Zhu M., Yuan Y., Rong Y., Xu S., Chen S., Mei J., Cheng, Y. [BLG gene knockout and hLF gene
knock-in at BLG locus in goat by TALENs] // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. – 2016. – Vol. 32. – P. 329-
338. [in Chinese]. DOI: 10.13345/j.cjb.150299
16. Sun Z., Wang M., Han S., Ma S., Zou Z., Ding F., Li X., Li L., Tang B., Wang H., Li N., Che H., Dai Y.
Production of hypoallergenic milk from DNA-free beta-lactoglobulin (BLG) gene knockout cow using zincfinger nucleases mRNA // Sci. Rep. – 2018. – Vol. 8. – 15430. DOI:10.1038/s41598-018-32024-x
17. Tan W.S., Carlson D.F., Walton M.W., Fahrenkrug S.C., Hackett P.B. Precision editing of large animal genomes
// Adv. Genet. – 2012. – Vol. – 80. – P. 37-97. DOI: 10.1016/B978-0-12-404742-6.00002-8
18. Wei J., Wagner S., Lu D., Maclean P., Carlson D.F., Fahrenkrug S.C., Laible G. Efficient introgression of allelic
variants by embryo-mediated editing of the bovine genome // Sci. Rep. – 2015. – Vol. 5. – P. 11735.
DOI: 10.1038/srep11735
19. Wei J., Wagner S., Maclean P., Brophy B., Cole S., Smolenski G., Carlson D.F., Fahrenkrug S.C., Wells D.N.,
Laible G. Cattle with a precise, zygote-mediated deletion safely eliminate the major milk allergen betalactoglobulin // Sci. Rep. – 2018. – Vol. 8. – P. 7661. DOI:10.1038/s41598-018-25654-8
20. Whitelaw C.B.A., Sheets T.P., Lillico S.G., Telugu B.P. Engineering large animal models of human disease //
J. Pathol. – 2016. – Vol. 238. – P. 247-256. DOI:10.1002/path.4648
21. Wright G., Carver A., Cottom D., Reeves D., Scott A., Simons P., Wilmut I., Garner I., Colman A. High level
expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep // Biotechnology (N.Y.). – 1991.
– Vol. 9. – P. 830-834.
22. Yu S., Luo J., Song Z., Ding F., Dai Y., Li N. Highly efficient modification of beta-lactoglobulin (BLG) gene
via zinc-finger nucleases in cattle // Cell Res. – 2011. – Vol. 21. – P. 1638-1164. DOI:10.1038/cr.2011.153
23. Zhou W., Wan Y., Guo R., Deng M., Deng K., Wang Z., Zhang Y., Wang F. Generation of beta-lactoglobulin
knock-out goats using CRISPR/Cas9 // PLoS One. – 2017. – Vol.12. – No. 10. – e0186056. DOI:
10.1371/journal.pone.0186056
24. Zhu H., Liu J., Cui C., Song Y., Ge H., Hu L., Li Q., Jin Y., Zhang Y. Targeting human α-lactalbumin gene
insertion into the goat β-lactoglobulin locus by TALEN-mediated homologous recombination // PLoS ONE. –
2016. – Vol. 11. – e0156636. DOI:10.1371/journal.pone.0156636