Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных – филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»
Исследования направлены на разработку методики получения фибробластов крупного рогатого скота и кролика, генетически трансформированных генно-инженерной конструкцией, содержащей репортёрный ген (с репортёрным геном) красного белка, с целью использования их в качестве источников (источника) кариопластов для получения трансгенных животных на основе технологии клонирования. Получены культуры фетальных фибробластов кролика и крупного рогатого скота, трансформированных конструкцией, включающей структурный ген лактоферрина человека (hLF) под промотором гена αS1-казеина крупного рогатого скота, репортёрный ген флуоресцентного красного белка (RFP) под цитомегаловирусным промотором (cmv) и селективный ген неомицинфосфотрансферазы (Neo) под промотором вируса sv40 (αS1-Cn-hLf-cmvRFP-svNeo). Показано, что кроличьи фетальные фибробласты хуже поддаются трансфекции кальций-фосфатным методом, по сравнению с фибробластами крупного рогатого скота, при времени адсорбции равном 24 ч и времени экспрессии 48 ч. Трансфекцию фетальных фибробластов кролика кальций-фосфатным способом удалось осуществить только при обработке их ДМСО. Фибробласты крупного рогатого скота хорошо трансформировались без применения протекторов; частота трансформации составила 8,6 на 105 клеток и эффективность трансформации − 3,5 на 105 клеток и 1 мкг ДНК конструкции при использовании 2,4 мкг ДНК конструкции и 7,6 мкг ДНК носителя. Добавление ДНК-носителя к ДНК-конструкции при трансфекции фетальных фибробластов липофектаминовым методом существенно повышало частоту трансфекции фибробластов крупного рогатого скота и не оказывало значительного влияния на частоту трансфекции фибробластов кролика.
1. Глебов О. К., Абрамян Д. С., Томилин Н.В. Генетическая трансформация соматических клеток. Цитология, 1985, 27, 4: 467-475.
2. Глебов О.К. Генетическая трансформация соматических клеток, 1989, Л.: 351 с.
3. Зубова Н. Н., Булавина А. Ю., Савицкий А. П. Спектральные и физико-химические свойства зеле-ного (GFP) и красного (drFP583) флуоресцирующих белков. Успехи биологической химии, 2003, 43: 163-176.
4. Езерский В.А., Колоскова Е.М., Шевченко В.Г. Создание генно-инженерных конструкций, вклю-чающих структурный ген лактоферрина человека под контролем регуляторных элементов гена -казеина крупного рогатого скота и гены : репортерный ген красного флуоресцентного белка или селективный ген устойчивости к неомицину. Проблемы биологии продуктивных животных, 2010, 4: 90-103.
5. Езерский В.А., Колоскова Е.М., Шевченко В.Г., Рябых В.П. Создание генно-инженерной конст-рукции, включающих структурный ген лактоферрина человека под контролем регуляторных эле-ментов гена αS1-казеина крупного рогатого скота с репортерным геном красного флуоресцентно-го белка и геном устойчивости к неомицину. Проблемы биологии продуктивных животных, 2012, 4: 5-17.
6. Рябых В.П. Итоги деятельности Всероссийского научно-исследовательского института физиоло-гии, биохимии и питания с.-х. животных (ВНИИФБиП). Мат. коорд. совещания 27-29 мая 2013 г. СПб.: 22-28.
7. Тевкин С.И., Трубицина Т.П., Шишиморова М.С., Езерский В.А., Рябых В.П. Частота интеграции трансгена и жизнеспособность кроличьих зигот, микроинъецированных разными генно-инженерными конструкциями. Технологии живых систем, 2010, 5: 42-49.
8. Степаненко О.В., Верхуша В. В., Кузнецова И. М., Туроверов К. К. Флуоресцентные белки: физи-ко-химические свойства и использование в клеточной биологии. Цитология, 2007, 49(5): 395-420.
9. Спандидос Д., Уилки Н. Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих. В кн.: Хеймс Б, Хиггинс С. Транскрипция и трансляция. Методы. М.: Мир, 1987: 10-23.
10. Ahn J.Y., Aoki N., Adachi T., Mizuno Y., Nakamura R., Matsuda T. Isolation and culture of bovine Mammary epithelial cells and establishment of gene transfection condition in the cells. Biosci. Biotech. Biochem., 1995, 59(1): 59-64.
11. Arat S., Gibbons J., Rzucidlo S.J., Repress D.S., Tumlin M., Stice S.L. In vitro development of bovine nuclear transfer embryos from transgenic clonal lines of adult and fetal fibroblast cells of the same geno-type. Biol. Reprod., 2002, 66: 1768-1774.
12. Bordignon V., Keyston R., Lazaris A., Bilodeau A.S., Pontes J.H., Arnold D., Fecteau G., Keefer C., Smith L.C . Transgene expression of green fluorescent protein and germ line transmission in cloned calves derived from in vitro transfected somatic cells. Biol. Reprod., 2003, 68: 2013-2023.
13. Cibelli J.B., Stice S.L., Golueke P.J. et al. Transgenic bovine chi-meric offspring produced from somatic cell-derived stem-like cells. Nat. Biotechnol., 1998, 16: 642-646.
14. Chaunan M.S., Nadir S., Bailey T.L., Pryor A.W., Butler S.P., Notter D.R., Velander W.H., Gwazdauskas F.C. Bovine follicular dynamics, oocyte recovery and development of oocytes microinjected with a green fluorescent protein construct. J. Dairy Sci., 1999, 82: 918-926.
15. Chiocchetti A., Tolosan E., Hirsch E., Silengo L., Altruda F. Green fluorescent protein as a reporter of expression in transgenic mice. Biochim. Biophys. Acta, 1997, 1352: 193-202.
16. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci., 1995, 20: 448-455.
17. Da Cruz M.T., Simoes S., Pires P.P., Nir S., de Lima M.C. Kinetic analysis of the initial steps involved in lipoplex-cell interactions: effect of various factors that influence transfection activity. Biochim. Biophys. Acta, 2001, 1510: 136-151.
18. Damme M.P., Tiglias J., Nemat N., Preston B.N. Determination of charge content at the surface of cells using a colloid titration technique. Anal. Biochem., 1994, 223: 62-70.
19. 27
20. Graham F L., Van der Eb A.J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology, 1973, 52: 456-467.
21. Hanifi A., Fathi M.H., Sadeghi М.H. Effect of strontium ions substitution on gene delivery related prop-erties of calcium phosphate nanoparticles. J. Mater. Sci. Mater. Med., 2010, 21(9): 2601-2609.
22. Iguma L.T., Lisauskas S.F.C., Melo E.O., Franco M.M., Pivato I., Vianna G.R., Sousa R.V., Dode M. A.N., Aragao F.J.L., Rech E.L., Rumpf R. Development of bovine embryos reconstructed by nuclear transfer of transfected and non-transfected adult fibroblast cells. Genet. Mol. Res., 2005, 4(1): 55-66.
23. Kuhholzer B., Hawley R.J., Lai L., Kolber-Simonds D., Prather R.S. Clonal lines of transgenic fibroblast cells derived from the same fetus result in different development when used for nuclear transfer in pigs. Biol. Reprod., 2001, 64: 1695-1698.
24. Li S., Guo Y., Shi J., Yin C., Xing F., Xu L., Zhang C., Liu T., Li H., Du L., Chen X. Transgene expression of enhanced green fluorescent protein in cloned rabbits generated from in vitro-transfected adult fi-broblast. Transg. Res., 2009, 18: 227-235.
25. Limonta J., Castro F., Martinez R., Durentes P., Ramos B., Aguilar A., Leonart R., De Lafuente J. Trans-genic rabbits as bioreactors for the production of human growth hormone. J. Biotectnol., 1995, 40: 43-58.
26. Liu Y., Wang T., He F., Liu Q., Zhang D., Xiang S., Su S., Zhang J. An efficient calcium phosphate na-noparticle- based nonviral vector for gene delivery. Int. J. Nanomed., 2011, 6: 721-727.
27. Maurisse R., De Semir D., Emamekhoo H., Bedayat B., Abdolmohammadi A., Parsi H., Gruenert D.C. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineag-es. Biotechnology, 2010, 10: 9-16.
28. Melo E.O., Sousa R.V., Iguma L.T., Franco M.M., Rech E.L., Rumpf R. Isolation of transfected fibrob-last clones for use in nuclear transfer and transgene detection in cattle embryos. Gen. Mol. Res., 2005, 4(4): 812-821.
29. Murakami M., Fahrudin M., Varisanga M.,D., Suzuki T. Fluorescence expression by bovine embryos after pronuclear microinjection with the EGFP gene. J. Vet. Med. Sci., 1999, 61(7): 843-847.
30. Oliveira R.R., de Carvalho D.M., Lisauskas S., Mello E., Vianna G.R., Dode M.A.N, Rumf R., Aragao F. J.L, Rech E.L. Effectiveness of liposomes to transfect livestock fibroblasts. Gen. Mol. Res., 2005, 4(2): 185-196.
31. Park K.W., Lai L., Cheong H.T., Cabot R., Sun Q.Y., Wu G., Rucker E.B., Durtschi D. Bonk., Samuel M., Rieke A., Day B.N. Mosaic gene expression in nuclear transfer-derived embryos and the production of cloned transgenic pigs from ear-derived fibroblasts. Biol. Reprod., 2002, 66: 1001-1005.
32. Rowell A.M., Talbot N.C., Wells K.D., Kerr D.E., Pursel V.G., Wall R.J. Cell donor influences success of producing cattle by somatic cell nuclear transfer. Biol. Reprod., 2004, 70(1): 210-216.
33. Sakurai F., Inoue R., Nishino Y., Okuda A., Matsumoto O., Taga T., Yamashita F., Takakura Y., Hashi-da M. Effect of DNA/liposome mixing ratio on the physicochemical characteristics, cellular uptake and intracellular trafficking of plasmid DNA/cationic liposome complexes and subsequent gene expression. J. Contr. Rel., 2000, 66: 255-269.
34. Sato K., Hosaka K., Ohkawa M., Tokieda Y., Ishiwata I. Cloned transgenic mouse fetuses from embryo-nic stem cells. Human cell, 2001, 14: 301-304.
35. Schnieke A.E., Kind A.J., Ritchie W.A., McWhir J., Campbell K.H.S., Wilmut I. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblast. Science, 1997, 278: 2130-2133.
36. Shaner N.C., Lin Michael Z., McKeown M. R., Steinbach P.A., Hazelwood K.L., Davidson M.W., Tsien R.Y. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nature Me-thods, 2008, 5(6): 545-549.
37. Wall R., Siedel G.E. Transgenic farm animals-a critical analysis. Theriogenology, 1992, 38: 337-357.
38. Wall R., Korr D.E., Bondioli K.R. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale. J. Dairy Sci., 1997, 80: 2213-2224.
39. Wurm F.M., Jordan M. Methods for calcium phosphate transfection .United states patent No. 5, 593,875. Jan. 14, 1997.
40. Yin X. J., Lee H.S., Yu X.F., Choi E., Koo B.C., Kwon M.S., Lee Y.S., Cho Su J., Jin G.Z., Kim L. H., Shin H.D., Kim T., Kim N.H., Kong K. Generation of cloned transgenic cats expressing red fluorescence protein. Biol. Reprod., 2008, 78: 425-431.