Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных – филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»
Клонирование и экспрессия альфа- и бета-субъединиц фолликулостимулирующего гормона
- Номер: 4
- Страницы: 104-110
Журнал: Проблемы биологии продуктивных животных
Аннотация:
В статье описано построение векторов и проведение бактериальной экспрессии рекомбинантного ФСГ крупного рогатого скота (бФСГ) для получения миллиграммовых количеств его белковых субъединиц. Один из членов семейства гонадотропинов − гликозилированный белковый бФСГ играет важную роль в размножении и может быть получен в разных системах для гетерологической экспрессии с сохранением своей нативной структуры. Клетки E. coli были выбраны в качестве организма хозяина для производства миллиграммовых количеств этого белка, поскольку даже негликозилированная бактериальная форма рекомбинантного бФСГ в определённой степени сохраняет биологическую активность. Основная часть альфа- и бета-субъединиц белка бФСГ синтезируется в форме телец включения, независимо от типа используемого вектора (pET-28a (+) и pET40b (+)) и используемой температуры экспрессии (16°C и 37°С). Биосинтез в виде телец включения обязывает проводить их солюбилизацию в денатурирующих условиях с последующим рефолдингом белка в правильную для функционирования форму. Промывка телец включения с последующим фракционированием сульфатом аммония приводит к белку с высокой степенью очистки – около 80%. Одновременная экспрессия отдельных субъединиц в одной и той же клетке хозяина возможна и имеет некоторые преимущества. Негликозилированный бФСГ, а также его отдельные субъединицы могут быть использованы в дальнейших исследованиях, в том числе для изучения их нативной конформации и биологического действия с целью разработки новых эффективных подходов для совершенствования репродуктивных технологий в животноводстве.
Литература:
1. Basu A., Li X., Leong S.S. Refolding of proteins from inclusion bodies: rational, design and recepies. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, 92(2): 241-251.
2. Burgess R.R. Refolding solubilized inclusion body protens. Methods Enzymol., 2009, 463:259-282.
3. Bursakov S.A., Kovalchuk S.N., Popov D.V., Kosovsky G.Yu. (Recombinant follicle-stimulating hormone for induction of superovulation in cattle: сurrent state and perspectives (a review). Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology, 2016, 3: 5-24.
4. Cahoreau C., Klett D., Combarnous Y. Structure–function relationships of glycoprotein hormones and their subunits' ancestors. Front Endocrinol (Lausanne). 2015, 6:26.
5. Collins-Racie L.A., McColgan J.M., Grant K.L., DiBlasio-Smith E.A., McCoy J.M., LaVallie E.R. Production of recombinant bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli using the novel secretory fusion partner DsbA. Bio/Technology. 1995, 13: 982-987.
6. Georgiou G., Telford J.N, Shuler M.L., Wilson D.B. Localization of inclusion bodies in E.coli overproducing 13-1actamase or alkaline phosphatase. Appl. Environ. Microbiol. 1986, 52:1157-1161.
7. Goodwin R.G., Moncman C.L., Rottman F.M., Nilson J.H. Characterization and nucleotide sequence of the gene for the common alpha subunit of the bovine pituitary glycoprotein hormones. Nucleic Acids Res. 1983, 11(19): 6873-6882.
8. Hesser M.W. A survey of heterologous expression systems for the production of bovine follicle stimulating hormone and luteinizing hormone. All Dissertations. 2011, 692: 1-140.
9. Lilie H., Schwarz E., Rudolph R. Advances in refolding of proteins produced in E. coli. Current Opinion in Biotechnology. 1998, 9:497-501.
10. Missiakas D., Georgopoulos C., Raina S. The Escherichia coli dsbC (xprA) gene encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation. EMBO J. 1994, 13(8): 2013-2020.
11. Pierce J.G., Parsons T.F. Glycoprotein hormones: structure and function. Annu. Rev. Biochem. 1981, 50: 465-495.
12. Raina S., Missiakas D. Making and breaking disulfide bonds. Ann. Rev. Microbiol. 1997, 51: 179-202.
13. Rietsch A., Belin D., Martin N., Beckwith J. An in vivo pathway for disulfide bond isomerization in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, 93: 13048-13053.
14. Rogan D., Strauss C., Mapletoft R., Bo G., Tribulo H., Szkudlinski M., and Weintraub B. Opportunities for the production of recombinant gonadotropins for assisted reproduction and embryo transfer. In: Joint Convention Proceedings (Ameriacan Canadian Embryo Transfer Association). Montreal, Quebec, 2009, 59-67.
15. Schein C.H., Noteborn M.H.M. Formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coil is favored by lower growth temperature. Bio/Technology. 1988, 6: 291-294.
16. Sone M., Akiyama Y., Ito K. Differential in vivo roles played by DsbA and DsbC in the formation of protein disulfide bonds. J. Biol. Chem. 1997, 272: 10349-10352.
17. Strickland T.W., Thomason A.R., Nilson J.H., Pierce J.G. The common alpha subunit of bovine glycoprotein hormones: limited formation of native structure by the totally nonglycosylated polypeptide chain. J. Cell. Biochem. 1985, 29(3): 225-37.
18. Vashistha N., Panchal M., Dighe R., Muralidhar K. Buffalo pituitary gonadotropins: characterization of bacterially expressed recombinant alpha and hormone specific beta subunits. World Journal Life Science and Medical Research. 2013, 3(1):1-7
19. Wilson M.E., Morris J.C., Gibbons J.R. Bioactive, bacterial-derived recombinant bovine follicle-stimulating hormone. Rep. Fert. Dev. 2008, 21(1): 246-247.
20. Zapun, A., Missiakas D., Raina S., Creighton T.E. Structural and functional characterization of DsbC, a protein involved in disulfide bond formation in Escherichia coli. Biochemistry. 1995, 34: 5075-5089.
21. Zhao L.H., Chen J.L., Xu H., Liu J.W., Xu R.F. Cloning and expression of FSHb gene and the effect of FSHβ on the mRNA levels of FSHR in the local chicken. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 2010, 23(3): 292-301.