Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных – филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»
Высокое содержание кислого сывороточного протеина в молоке кролика делает ген этого белка перспективным кандидатом для замены геном биологически активного белка с использованием системы CRISPR/Cas9. Цель исследования − создание плазмиды, содержащей 5’- и 3’- плечи гомологии к областям гена WAP кролика, в которую можно будет интегрировать ДНК-последовательность целевого белка. На основе плазмиды рTZ57R/T была создана плазмида pTZrbWAPha, в место стыка плечей гомологии которой был введен сайт для эндонуклеазы рестрикции EagI, позволяющий клонировать ДНК целевого белка в плазмиду. Состав созданной плазмиды был подтвержден сиквенсом её фрагментов. Генетическая конструкция, содержащая ген зелёного флуоресцентного белка под cmv промотором, была встроена по сайту EagI в pTZrbWAPha. Была разработана стратегия внесения двухцепочечных разрезов в ген rbWAP и получены четыре плазмиды pX330, кодирующие эндонуклеазу Cas9 и направляющие РНК. Плазмида prbWAPcmvEGFP, содержащая фрагмент cmvEGFP, предназначена для сайт-специфичной интеграции ДНК-вставки гомологичной рекомбинацией в ген rbWAP для оценки эффективности работы подобранных компонентов системы CRISPR/Сas9 в условиях in vitro.
1. Езерский В.А., Шевченко В.Г. Создание генно-инженерной конструкции, содержащей структурный ген лактоферрина человека под контролем регуляторных элементов гена β-лактоглобулина крупного рогатого скота и репортерный ген GFP // Проблемы биологии продуктивных животных. – 2008. – Т. 2. – С. 3-12.
2. Мензоров А.Г., Лукьянчикова В.А., Кораблев А.Н., Серова И.А., Фишман В.С. Практическое руководство по редактированию геномов системой CRISPR/Cas9 // Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2016. – Т. 20. – № 6. – С. 930-944. DOI: 10.18699/VJ16.214
3. Шепелев М. В., Калиниченко С. В., Дейкин А. В., Коробко И. В. Получение рекомбинантных белков из молока трансгенных животных: современное состояние и перспективы// ACTA NATURAE. – 2018. – Т.10. – № 3. – С. 42-50.
4. Baranyi M., Brignon G., Anglage P., Ribadeau-Dumas B. New data on the protein of rabbit (Oryctolagus cuniculus) milk // Comp. Biochem. Physiol. – 1995. – Vol. 111B. – P. 407-415.
5. Bichoff R., Degzuse E., Perraud F., Dalemans W., Ali-Hadji D., Thépot D., Devinoy E., Houdebine L.M., Pavirani A. A 17,6 kb region located upstream of the rabbit WAP gene direct high-level expression of a functional human protein variant in transgenic mouser milk // FEBS. – 1992. – Vol. 305. – P. 265-268.
6. Bosze Z., Hiripi L., Carnwath J.W., Niemann H. The transgenic rabbit as model for human diseases and as a source of biologically active recombinant proteins // Transgenic. Res. – 2003. – Vol. 12. – P. 541-553.
7. Chrenek P., Makarevich A.V. Analysis of transgenic rabbit vitrified embryos carrying EGFP gene // Slovak J. Anim. Sci. // 2011. – Vol. 44. – No. 1. – P. 1-5.
8. Devinoy E., Malienou-N’Gassa R., Thepot D., Puissant C., Houdebine L.M. Hormone responsive elements within the upstream sequences of the rabbit whey acidic protein (WAP) gene direct chloramphenicol transferase (CAT) reporter gene expression in transfected rabbit mammary cells // Mol. Cell. Endocrin. – 1991. – Vol. 81. – P. 185-193.
9. Devinoy E., Thepot D., Stinnakre M.-G., Fontaine M.-L., Grabowski H., Puissant C., Pavirani A., Houdebine L.-M. High level production of human growth hormone in the milk of transgenic mice: the upstream region of the rabbit whey acidic protein (WAP) gene targets transgene expression to the mammary gland // Transg. Res. – 1994. – Vol. 3. – No. 2. – Р. 79-89.
10. Ebert K.M., Selgrath J.P., DiTullio P., Denman J., Smith T.E. et al. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression // Biotechnology (NY). – 1991. – Vol. 9. – Р. 835-838.
11. Gordon K., Lee E., Vitale J.A., Smith A.E., Westphal H., Hennighausen L. Production of human tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk // Nature Biotechn. – 1987. – Vol. 5. – Р. 1183-1187. doi:10.1038/nbt1187-1183
12. Iqbal K., Barg-Kues B., Broll S., Bode J., Niemann H. and Kues W.A. Cytoplasmic injection of circular plasmids allows targeted expression in mammalian embryos // BioTechniques. – 2009. – Vol. 47. – P. 959-968. DOI: 10.2144/000113270
13. Kues W.A., Niemann H. Advances in farm animal transgenesis // Prev. Vet. Med. – 2011. – Vol. 102. – P. 146-156.
14. Thepot D., Devinoy E., Fontaine M.L., Hubert C. and Houdebine L.M. Complete sequence of the rabbit whey acidic protein gene // Nucleic Acids Research. – 1990. – Vol. 18. – No. 12. – P. 36-41
15. Thépot D., Devinoy E., Fontaine M.L., Stinnakre M.G., Massoud M., Kann G., Houdebine L.M.. Rabbit whey acidic protein gene upstream region controls high-level expression of bovine growth hormone in the mammary gland of transgenic mice // Mol. Reprod. Dev. – 1995. – Vol. 42. – No. 3. – Р. 261-267.
16. Whitelaw C.B.A., Sheets T.P., Lillico S.G., Telugu B.P. Engineering large animal models of human disease // J. Pathol. – 2016. – Vol. 238. – Р. 247-256.