Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных – филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»
С появлением новых эндонуклеазных технологий стала возможной одноступенчатая генерация мутаций в нескольких генах одновременно, с участием одного или обоих аллелей (в том числе для получение гомозиготных животных в F0 поколении), введение в геном сразу нескольких трансгенов, нокаут собственного гена с заменой его трансгеном. По востребованности применения новых технологий в настоящее время лидирует получение животных-биомоделей с генами человека для проведения биомедицинских исследований, но не менее актуальной задачей является получение животных, продуцирующих биологически активные белки с молоком.
Цель данного исследования – создание генетической конструкции для совместной интеграции трансгена кДНК лактоферрина человека и зеленого флуоресцентного белка по CRISPR/Cas HDR механизму в локус бета-лактоглобулина крупного рогатого скота (bβLg) с одновременным его нокаутом на бластоцистах микроинъецированных зигот КРС. На основе ранее созданных авторами плазмид рβLghLf ирβLghLfcmvEGFP получена генетическая конструкция, включающая в себя последовательности кДНК чЛФ и гена зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в качестве репортерного, фланкированные плечами гомологии 5’- и 3`- регуляторным областям bβLg. Конструкцию предполагается использовать для получения эмбрионов КРС, трансгенных по hLf и/или нокаутных по βLg.
1. Езерский В.А., Иванова Л.Б., Шевченко В.Г. Создание генно-инженерной конструкции на основе регуляторных элементов гена b-лактоглобулина быка и структурного гена лактоферрина человека // Сб. науч. тр. ВНИИФБиП. – 2006. – Т. 45. – С. 121-137.
2. Езерский В.А., Шевченко В.Г. Создание генно-инженерной конструкции, содержащей структурный ген лактоферрина человека под контролем регуляторных элементов гена β-лактоглобулина крупного рогатого скота и репортерный ген GFP // Проблемы биологии продуктивных животных. – 2008. – № 2. – С. 3-12.
3. Максименко О.Г., Дейкин А.В., Ходарович Ю.М., Георгиев П.Г. Использование трансгенных живот-ных в биотехнологии: перспективы и проблемы // Acta naturae. – 2013. – Т. 5. – № 1(16). – С. 33-47.
4. Разин С.И., Вербовая Л.В., Гольдман И.Л. Новые подходы к созданию трансгенных животных с высоким уровнем тканеспецифической экспрессии чужеродных генов: конструирование и реконструкция геномных доменов // Генетика. – 2000. – Т. 36. – № 11. – С. 1443-1453.
5. Caffin J.P., Poutrel B., Rainard P. Physiological and pathological factors influencing bovine alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin concentrations in milk // J. Dairy Sci. – 1985. – Vol. 68. – P. 1087-1094.
6. Capecchi M.R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century // Nat. Rev. Genet. – 2005. – Vol. 6. – P. 507-512.
7. Cui C., Song Y., Liu J., Ge H., Li Q., Huang H., Hu L., Zhu H., Jin Y., Zhang Y. Gene targeting by TALEN-induced homologous recombination in goats directs production of β- lactoglobulin-free, high-human lactoferrin milk // Scientific reports. – 2015. – Vol. 5. – P. 1-11. doi:10.1038/srep10482
8. Hyttinen J.M., Korhonen V.P., Hiltunen M.O., Myohanen S., Janne J. High-level expression of bovine beta-lactoglobulin gene in transgenic mice // J. Biotechnol. – 1998. – Vol. 13. – No. 3. – P. 191-198.
9. Korhonen V.P., Tolvanen M., Hyttinen J.M., Uusi-Oukari M., Sinervirta R., Alhonen L., Jauhiainen M., Janne O.A., Janne J. Expression of bovine beta-lactoglobulin/human erythropoietin fusion protein in the milk of transgenic mice and rabbits // Eur. J. Biochem. – 1997. – Vol. 15. – No. 2. – P. 482-489.
10. Liu Z., Zhao C., Fan B., Dai Y., Zhao Z. et al. Variable expression of human lactoferrin gene in mice milk driven by its 90 KB upstream flanking sequences // Anim. Biotechnol. – 2004. – Vol. 15. – P. 21-31.
11. McClenaghan М., Springbett A., Wallace R. Secretory proteins compete for production in the mammary gland of transgenic mice // Biochem. J. – 1995. – Vol. 310. – P. 637-641.
12. McKee C., Gibson A., Dalrymple M., Emslie L., Garner I., Cottingham I., Production of biologically active salmon calcitonin in the milk of transgenic rabbits // Nature Biotechnology. – 1998. – Vol. 16. – No. 7. – P. 647-651.
13. Pervaiz S., Brew K. Homology of beta-lactoglobulin, serum retinol-binding protein, and protein HC // Science. – 1985. – Vol. 228. – P. 335-337.
14. Shu J.H., Zhang Y., Pan Z.F., Peng S.Y., Cao J.W., Li X.C. Construction of expression vector of human lactoferrin and its expression in bovine mammary epithelial cells // Belg. J. Zool. – 2007. – Vol. 137. – No. 2. – P. 231-237.
15. Simons J., McClenaghan M., Clarc A. Alteration of the quality of milk by expression of sheep beta-lactoglobulin in transgenic mice // Nature. – 1987. – Vol. 328. – P. 530-532.
16. Torres-Ruiz R., Rodriguez-Perales S. CRISPR-Cas9: A revolutionary tool for cancer modelling // Int. J. Mol. Sci. – 2015. – Vol.16. – P. 22151-22168. doi:10.3390/ijms160922151
17. Whitelaw C.B., Harris S., McClenaghan M., Simons J.P., Clark A.J. Position-independent expression of the ovine beta-lactoglobulin gene in transgenic mice // Biochem. J. – 1992. – Vol. 286. – P. 31-39.
18. Whitelaw C.B.A., Sheets T.P., Lillico S.G., Telugu B.P. Engineering large animal models of human disease // J. Pathol. – 2016. – Vol. 238. – P. 247-256.
19. Wright G., Carver A., Cottom D. et al. High-level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep // Bio/Technol. – 1991. – Vol. 9. – P. 830-834.
20. Zhu H., Liu J., Cui C., Song Y., Ge H., Hu L., Li Q., Jin Y., Zhang Y. Targeting human α-lactalbumin gene insertion into the goat β-lactoglobulin locus by TALEN-mediated homologous recombination // PloS One. – 2016. – Vol. 11. – No. 6. doi: 10.1371/journal.pone.0156636